Το προφίλ της ImmunoRec

Επισκόπηση της εταιρείας

ImmunoRec είναι μια spin-off εταιρεία που ξεκίνησε επίσημα τη λειτουργία της τον Ιούλιο του 2021 και έχει στόχο την εκμετάλλευση της νέας στρατηγικής της εξωσωματικής ανοσορρύθμισης, που είναι γνωστή ως  «εξατομικευμένο εμφυτεύσιμο εμβόλιο» , “vaccine–on–chip”, “organ–on–chip”.

Στόχος: Ανοσοθεραπεία του καρκίνου.

Portfolio:

• Δίπλωμα ευρεσιτεχνίας “Εξατομικευμένο εμφύτευμα κατά του καρκίνου” (ΟΒΙ 20190100297) (venture capital)
• Δίπλωμα ευρεσιτεχνίας «Εξατομικευμένο εμβόλιο κατά του SARS-CoV-2» (OBI 245-0004327167, υπό αξιολόγηση)

ImmunoRec PITCH

Η ImmunoRec είναι μια spin-off εταιρεία του Πανεπιστημίου Κρήτης με αρχικό στόχο την υλοποίηση της κλινικής μελέτης φάσης Ι για εξατομικευμένη θεραπεία κατά του καρκίνου (δίπλωμα ευρεσιτεχνίας ΟΒΙ 20190100297). Η νέα τεχνολογία χαρακτηρίζεται από τον Εθνικό Οργανισμό Φαρμάκων ως ανοσοθεραπεία κατά του καρκίνου με δραστική ουσία αυτόλογα μακροφάγα, προενεργοποιημένα έναντι αυτόλογων καρκινικών αντιγόνων, προσροφημένα σε επιφάνεια πυριτίου και εντάσσεται στην κατηγορία συνδυασμένων φαρμακευτικών προϊόντων προηγμένης θεραπείας. Ο μελλοντικός στόχος της εταιρείας είναι η εδραίωσή της ως «Κέντρο Εξωσωματικής Ανοσοποίησης-ΚΕΑ» στο οποίο οι ασθενείς θα λαμβάνουν το εξατομικευμένο, ενεργοποιημένο εμφύτευμα αυτόλογων ογκο-αντιγόνων και στη συνέχεια θα παρακολουθούνται σε συνεργασία με τους ογκολόγους τους. Χωρίς παρενέργειες, Χωρίς να χρειαστεί να σταματήσουν άλλες θεραπείες.

Ιστορικό

Η ImmunoRec είναι αποτέλεσμα 10ετούς εργαστηριακής έρευνας και συνεργασίας του Εργαστηρίου Ανοσολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης με το Εργαστήριο Μικρο-νανο-δόμησης υλικών με υπερβραχείς παλμούς λέιζερ του Ινστιτούτου Ηλεκτρονικής Δομής και Λέιζερ του Ιδρύματος Τεχνολογίας και Έρευνας.

Σε μια από αυτές τις συναντήσεις των επιστημονικών αναζητήσεων, το 2009, οι άνθρωποι του εργαστηρίου Ανοσολογίας κατέθεταν τους προβληματισμούς τους για την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα των εμβολίων, ενώ οι άνθρωποι του εργαστηρίου Μικρο- νανο-δόμησης υλικών εξηγώντας τις δυνατότητές τους, αναζητούσαν κάποια εφαρμογή των βιομιμητικών υλικών που δημιουργούσαν. Και έτσι γεννήθηκε η ιδέα των «εξατομικευμένων εμφυτεύσιμων εμβολίων».

Από το 2009 και μετά, πολλοί νέοι ερευνητές και από τα δύο επιστημονικά πεδία εργάστηκαν για την ανάπτυξη, επέκταση και βελτιστοποίηση της καινοτόμου τεχνολογίας που προέκυψε:

Γιατί να χρησιμοποιήσετε την τεχνολογία των «εξατομικευμένων εμφυτεύσιμων εμβολίων»

Εφαρμογή στον καρκίνο

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η αρχική ιδέα της ανοσοθεραπείας κατά του καρκίνου βασίστηκε στην απομόνωση ή/και γενετική τροποποίηση αυτόλογων Τ κυττάρων που ήταν ειδικά για τους αντιγονικούς επιτόπους ενός όγκου, και απετέλεσε μια ενθαρρυντική προσπάθεια για την καταπολέμηση των εγγενώς καρκινικών κυττάρων. Τέτοιες κυτταρικές θεραπείες (adaptive cell transfer, ACT) περιλαμβάνουν τη χρήση λεμφοκυττάρων που διεισδύουν σε όγκους (tumor infiltrating lymphocytes, TILs), καθώς και γενετικά τροποποιημένα Τ κυττάρων ασθενών ώστε να εκφράζουν συγκεκριμένους υποδοχείς Τ κυττάρων (T cell receptors, TCRs) ή θραύσματα συνθετικών αντισωμάτων που αναγνωρίζουν καρκινικούς επιτόπους και συνδέονται με διάφορα συνδιεγερτικά μόρια της κυτταρικής επιφάνειας, γνωστά ως χιμαιρικοί υποδοχείς αντισωμάτων (chimeric antibody receptors CARs) [1].

Τα ΤILs περιλαμβάνουν τόσο τα Β όσο και τα Τ λεμφοκύτταρα που βρίσκονται μέσα ή γύρω από τον όγκο και εμφανίζουν αντικαρκινική δραστηριότητα. Σε αυτή την περίπτωση τα Τ λεμφοκύτταρα εκφράζουν ειδικούς υποδοχείς για τα ογκο-αντιγόνα και ασκούν κυτταροτοξική δράση μέσω της αλληλεπίδρασής τους με το σύμπλοκο που σχηματίζουν τα μόρια ιστοσυμβατότητας τάξης Ι (MHC-class Ι) με τα ογκο-αντιγονικά επίτοπα [2]. Αυτή η προσέγγιση, αν και παρέχει υποσχόμενα αποτελέσματα σε ορισμένους τύπους όγκων, απαιτεί την παρουσία προ-υπαρχόντων TILs με κυτταροτοξική δράση, κάτι που δεν συμβαίνει πάντα.

Οι περιορισμοί του αντιγονο-ειδικών TILs οδήγησαν στην  ανάπτυξη γενετικά τροποποιημένων Τ κυττάρων που εκφράζουν ειδικούς ΤCRs ή CARs. Οι ειδικότητες των υποδοχέων που χρησιμοποιήθηκαν αρχικά εστιαζόταν σε κοινά ογκο-αντιγόνα που χαρακτηρίζουν συγκεκριμένους τύπους όγκων, αλλά με το πέρασμα του χρόνου, οι θεραπείες στράφηκαν σε νέο-αντιγόνα του ίδιου του ασθενή, σε ένα πλαίσιο εξατομικευμένης τύπου ανοσοθεραπείας [3]. Στην περίπτωση της γενετικής τροποποίησης CAR, τα κατασκευασμένα αντισώματα (scfv) έχουν συνδεθεί με διάφορα τμήματα συνδιεγερτικών μορίων, συμπεριλαμβανομένων των CD28, CD137, CD3ζ [4-6].

Προσπαθώντας να υπερκεράσει αυτές τις θεαματικές, αλλά ταυτόχρονα δαπανηρές, χρονοβόρες και περιορισμένης αποτελεσματικότητας στρατηγικές, η ImmunoRec επικεντρώνεται στην εφαρμογή της  τεχνολογίας εξατομικευμένων εμφυτεύσιμων εμβολίων [7]. Σύμφωνα με αυτή τη στρατηγική, οι ιδρυτές χρησιμοποιώντας μια ειδικά τροποποιημένη βιομιμητική επιφάνεια πυριτίου για την προσέλκυση των αυτόλογων μακροφάγων του εκάστοτε ατόμου, προκαλούν την  παρουσίαση του αντιγόνου εκτός οργανισμού (in vitro), κάτι που δίνει τη δυνατότητα ελέγχου της κατάλληλης δόσης των νέο-αντιγόνων. Η εμφύτευση αυτής της προ-ενεργοποιημένης επιφάνειας διεγείρει την παραγωγή από τον ίδιο τον οργανισμό ογκο-ειδικών Τ και Β κυττάρων που επιτίθενται στον όγκο.  Μια τέτοια διαδικασία επιτρέπει την πρόσληψη, επεξεργασία και φυσική φόρτωση του αντιγόνου σε μόρια MHC. Πράγματι, η επεξεργασία του αντιγονικού επιτόπου είναι μια πολύπλοκη και όχι καλά κατανοητή διαδικασία, καθώς σχετίζεται άμεσα με τον απλότυπο MHC και το γενετικό υπόβαθρο του κάθε ατόμου.

1. Επιστημονικό υπόβαθρο και Αρχές

Η ανάπτυξη μιας ανοσολογικής απόκρισης βασίζεται στην επιτυχημένη παρουσίαση του αντιγόνου από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APCs). Η επικρατούσα παραδοσιακή άποψη για την παρουσίαση αντιγόνου είναι ότι ενδοκυττάρια αντιγόνα (ιοί ή αντιγόνα όγκων) παρουσιάζονται από τάξης Ι αντιγόνα του μείζονος  συμπλόκου ιστοσυμβατότητας (MHC) και ενεργοποιούν CD8⁺ κυτταροτοξικά Τ κύτταρα (T_c), ενώ τα εξωκυττάρια αντιγόνα παρουσιάζονται από εξειδικευμένα APCs με τάξης ΙΙ MHC μόρια σε CD4⁺ Τ βοηθητικά  κύτταρα (Τ_Η) κύτταρα. Τα εξωκυττάρια αντιγόνα ενδοκυτώνονται σε φαγοσώματα ή ενδοσώματα τα οποία ωριμάζουν και υποβάλλονται σε μια σειρά μοριακών αλλαγών, όπως οξίνιση και σύντηξη με οργανίδια που περιέχουν ένζυμα αποικοδόμησης, ιδίως λυσοσώματα. Τα παραγόμενα αντιγονικά πεπτίδια φορτώνονται σε μόρια MHC τάξης II, μεταφέρονται στην επιφάνεια του κυττάρου και παρουσιάζονται σε κύτταρα CD4⁺ T_H [9] .

Η ενεργοποίηση των T_H αντιπροσωπεύει μία από τις πιο σημαντικές δραστηριότητες του ανοσοποιητικού συστήματος, εφόσον οδηγεί τόσο σε χυμική όσο και κυτταρική ανοσία  και ανοχή. Έτσι, οι T_H διεγείρουν τα Β κύτταρα για παραγωγή ειδικών αντισωμάτων ή τα T_c για θανάτωση κυτταρικών στόχων, ενώ η έκφραση αρνητικών επιφανειακών μαρτύρων καταστέλλει τους δύο τύπους ανοσίας εξασφαλίζοντας τη διατήρηση ομοιόστασης στο ανοσοποιητικό σύστημα.

Η οποιαδήποτε ουσία μπορεί να ενεργοποιήσει μια αναοσολογική απόκριση. Ουσίες μικρού μοριακού βάρους (<2000 d), οι απτίνες επάγουν ειδική ανοσοαπόκριση όταν είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένες με ένα μεγαλύτερο ανοσογόνο μόρια, τον φορέα. Σε αυτές τις περιπτώσεις είναι επίσης απαραίτητη η ταυτόχρονη μη αντιγονοειδική ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος που επιτυγχάνεται με γαλακτοποίηση του αντιγόνου σε ανοσοενισχυτικά.

Ανοχή είναι ένα ανοσολογικό φαινόμενο με μνήμη και ειδικότητα και χαρακτηρίζεται από απουσία ή καταστολή απόκρισης. Ένας από τους σημαντικότερους μηχανισμούς που συμβάλλουν στη διατήρηση της αυτο-ανοχής είναι η ανάπτυξη της ανοσοκαταστολής. Ο όρος αυτός περιλαμβάνει την ανάπτυξη συγκεκριμένων κυτταρικών πληθυσμών που ασκούν αρνητικές ρυθμιστικές επιδράσεις σε κυτταρικούς στόχους, είτε μέσω κυτταρικής επαφής ή μέσω διαλυτών προϊόντων. Η εμφάνιση ενός νέου αντιγόνου οδηγεί τον οργανισμό σε ανοσολογική διέγερση ή καταστολή ανάλογα με τη φύση του αντιγόνου, την οδό ανοσοποίησης, τη συγκέντρωση του αντιγόνου και την ηλικία του οργανισμού. Η χορήγηση του αντιγόνου με ανοσοενισχυτικό επάγει ανοσία αντί για ανοχή.

Η ανάπτυξη αποτελεσματικής και χωρίς παρενέργειες ανοσοποίησης ενάντια στον καρκίνο είναι ένα αινιγματικό και ανοιχτό θέμα στην έρευνα. Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα είναι η αδυναμία ανοσοαπόκρισης έναντι των αντιγόνων που σχετίζονται με τον όγκο (ΤΑΑ) διότι αυτά συνήθως αναγνωρίζονται από το ανοσοποιητικό σύστημα ως αυτο-αντιγόνα. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν πολλαπλά νεοαντιγόνα, τα οποία είναι ειδικά για κάθε όγκο, και τις περισσότερες φορές είναι ειδικά για το κάθε άτομο. Τα νεοεπίτοπα δημιουργούνται στα καρκινικά κύτταρα μέσω σημειακών μεταλλάξεων, προσθηκών/διαγραφών, ενισχύσεων/διαγραφών, μετατοπίσεων, αναστροφών κλπ [10]. Επειδή τα νεοεπίτοπα εξαιρούνται από την κεντρική ανοχή, θα μπορούσαν να διεγείρουν τη παραγωγή εξειδικευμένων Τ κύτταρων υψηλής συγγένειας. Η επιλογή ενός νεοεπιτόπου, θα μπορούσε να οδηγήσει στην κατασκευή ενός εξατομικευμένου εμβολίου για τον εκάστοτε ασθενή.  Πράγματι, ο εμβολιασμός με βάση τη μεταλλαξιγένεση θα μπορούσε να εντοπίσει πολλαπλά κοινά νεοαντιγόνα, συμπεριλαμβανομένων των mutRas, mutP53, mutVHL, mutEGFR ή mutIDH1 [10], τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη διάγνωση και τη διαχείριση πρωτοκόλλων θεραπευτικού εμβολιασμού. Ωστόσο, η εισαγωγή τεχνολογιών αλληλούχισης επόμενης γενεάς (NGS) έδειξε ότι ο καρκίνος στον άνθρωπο είναι γονιδιακά  πολύ πιο περίπλοκος από ότι αρχικά είχε υποτεθεί, αποκαλύπτοντας χιλιάδες μεταλλάξεις που θα μπορούσαν να παρέχουν πιθανά νεοεπίτοπα για παρουσίαση από τα MHC τάξης Ι μόρια [11,12]. Η χαρτογράφηση όλων των σωματικών μεταλλάξεων ενός μεμονωμένου όγκου, που αναφέρεται ως “mutanome”, θα μπορούσε να επιτρέψει την επιλογή των νεοεπιτόπων. Ωστόσο, τα κοινά νεοαντιγόνα του πληθυσμού έχουν χρησιμοποιηθεί ανεπιτυχώς σε τεχνολογίες εμβολίων. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η αποτυχία του εμβολίου έγκειται στην επιλογή νεοεπιτόπου και του φορέα καθώς και του  ανοσοενισχυτικού. Σύμφωνα με την τεχνολογία των εμβολίων δεύτερης γενιάς, τα νεοεπίτοπα συνδέονται με έναν φορέα και χορηγούνται με ανοσοενισχυτικό ή με μεταβλητά βιοδιασπούμενα υλικά που είναι  θεωρητικά σχεδιασμένα να στοχεύουν τον όγκο. Ωστόσο, καμία από αυτές τις προσεγγίσεις δεν έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για τη θεραπεία του καρκίνου. Οι λόγοι αυτής της αποτυχίας περιλαμβάνουν: 1) Νεοεπίτοπα: η επιλογή τους είναι δύσκολη, χρονοβόρα και αμφίβολη ως προς την αποτελεσματικότητα ανάπτυξης μιας κατάλληλης ανοσοαπόκρισης, 2) Φορείς: οι περισσότεροι από αυτούς ευνοούν την χυμική έναντι της κυτταρικής ανοσίας και επειδή τα μόρια αυτά είναι από τη φύση τους ανοσογόνα, παραπλανούν την ανάπτυξη ανοσίας ενάντια στα θεμιτά νεοεπίτοπα, 3) Ανοσοενισχυτικά: μόνο λίγα από τα διαθέσιμα σκευάσματα συνταγογραφούνται για ανθρώπινη χρήση τα οποία και πάλι παρουσιάζουν σοβαρές παρενέργειες και 4) Στοχευμένο βιοδιασπούμενο υλικό: μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμο με την πρόοδο της έρευνας, αλλά η ειδική χωρίς παρενέργειες στόχευση εξακολουθεί να είναι ένας πολύ δύσκολος στόχος. Επιπρόσθετα, μια άλλη παράμετρος που πρέπει να ληφθεί υπόψη είναι η ύπαρξη ανοσοκατασταλτικών μηχανισμών που σχετίζονται με τον όγκο και περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων μηχανισμών την αναστολή των κυττάρων Τ που σχετίζονται με την ανοχή [13] καθώς επίσης και την ανάπτυξη  προερχόμενων από κοκκιοκύτταρα-μακροφάγα κατασταλτικών κυττάρων (MDSCs) [14], τα οποία θα μπορούσαν να ακυρώσουν την ειδική απόκριση ενάντια στα νεοεπίτοπα.

Για να ξεπεραστούν αυτά τα προβλήματα, η παρούσα εφεύρεση εκμεταλλεύεται προηγούμενη εμπειρία του εργαστηρίου και παρουσιάζει το σχεδιασμό εμφυτεύσιμων εμβολίων για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου που διεγείρουν όχι μόνο την χυμική αλλά και την κυτταρική ανοσοαπόκριση έναντι του ειδικού όγκου του κάθε ατόμου. Το όραμα προς μια εξειδικευμένη ως προς το αντιγόνο ανοσοδιέγερση in vivo θα ήταν να βρεθεί ένας τρόπος για να ενεργοποιηθούν τα κύτταρα Τ_Η χωρίς την ανάγκη πρόσθετων ουσιών. Κατά τη φυσική μόλυνση ο οργανισμός αναπτύσσει ανοσοαπόκριση κατά τρόπο εξαρτώμενο από αντιγόνο. Τα αντιγόνα θα είναι ανοσογόνα, εάν καταφέρουν να υποβληθούν σε επεξεργασία και να παρουσιαστούν από τα APC. Οι αρχικές προσπάθειες προς αυτή την κατεύθυνση ήταν η ανάπτυξη εμφυτεύσιμων ικριωμάτων με ρυθμιζόμενη μορφολογία και χημεία και η διερεύνηση του κατά πόσο προ-ενεργοποιημένα μακροφάγα που απορροφούνται σε αυτό το υλικό θα ήταν ικανά να διεγείρουν την ανάπτυξη μιας χυμικής ανοσολογικής απόκρισης [15]. Αν και μια τέτοια προσέγγιση αντιπροσωπεύει έναν εξατομικευμένο εμβολιασμό, εξαλείφει όλες τις παρενέργειες που οφείλονται στη μη ειδική διέγερση των ανοσοενισχυτικών.

Η ασφάλεια του εμβολίου είναι ένα σοβαρό θέμα που απασχολεί τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας από την έναρξη της ανάπτυξης της τεχνολογίας εμβολιασμού. Αν και τα νεοεπίτοπα είναι απαλλαγμένα από μολυσματικότητα, τα ανοσοενισχυτικά και/ή το υλικό του φορέα είναι επιρρεπή σε παρενέργειες, οι οποίες θα μπορούσαν να αξιολογηθούν μόνο μετά από μαζική χρήση, προκαλώντας έτσι σοβαρά ζητήματα βιοηθικής. Η χρήση μη βιοαποικοδομήσιμων εμφυτευμάτων αποφεύγει τις εξαρτώμενες το ανοσοενισχυτικό παρενέργειες, παρέχοντας παράλληλα την αναγκαία ανοσοδιέγερση στον ξενιστή [15]. Η τεχνολογία που εφαρμόζεται από την ΙmmunoRec επιτρέπει στα APCs του ξενιστή να παρουσιάσουν το “mutanome” του όγκου, εξασφαλίζοντας έτσι την καλύτερη παρουσίαση νεοαντιγόνου για κάθε άτομο. Όπως ήδη αναφέρθηκε, η ανοχή εξαρτάται από τη φύση του αντιγόνου, την οδό ανοσοποίησης, τη συγκέντρωση του αντιγόνου και την ηλικία του οργανισμού. Από την άλλη πλευρά, στο πλαίσιο της ανοσολογικής διαφυγής, πολλοί όγκοι αναπτύσσουν μηχανισμούς εξάντλησης του ανοσοποιητικού συστήματος προς όφελός τους, όπως στην περίπτωση του προγραμματισμένου θανάτου έκφρασης προσδέτη-1 (PDL-1) [13]. Η προγραμματισμένη πρωτεΐνη θανάτου κυττάρων 1 (PD-1) εκφράζεται φυσικά στα Τ κύτταρα κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσής τους στο θύμο προάγοντας την αυτο-ανοχή και ενεργοποιώντας την απόπτωση των αυτό-δραστικών Τ κυττάρων. Ωστόσο, τέτοιοι μηχανισμοί σχετίζονται άμεσα με τη συγγένεια και τη διαθεσιμότητα του TCR για το σύμπλοκο αντιγόνου/MHC και ελέγχουν την ανάπτυξη διεγερτικών έναντι κατασταλτικών διαμεσολαβητών [16, 17, 18].

2. Τεχνολογία εμφυτεύσιμου εμβολίου στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου

Το στερεό βιοϋλικό που χρησιμοποιείται για την υποστήριξη της κυτταρικής ανάπτυξης μπορεί να είναι οποιοδήποτε μη-βιοδιασπούμενο, μη τοξικό υλικό ικανό να επιτρέψει τη φυσική φόρτωση του αντιγόνου, την παρουσίασή του in vitro, καθώς και περαιτέρω ενεργοποίηση της ανοσοαπόκρισης in vivo. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι τα τρισδιάστατα μικροδομημένα εμφυτεύσιμα ικριώματα κατασκευασμένα με λέιζερ υποστήριξαν την προσκόλληση μακροφάγων ποντικών, επέτρεψαν τη φυσική σπορά με ανθρώπινη λευκωματίνη ορού (αντιγόνο) και επετεύχθη η παραγωγή ειδικών αντισωμάτων και φλεγμονωδών κυτοκινών in vitro. Η εμφύτευση αυτών των ικριωμάτων πυριτίου φορτωμένων με ενεργοποιημένα από το αντιγόνο μακροφάγα προκάλεσε μια ήπια φλεγμονώδη αντίδραση μαζί με την παραγωγή αντιγονο-ειδικών αντισωμάτων in vivo, η οποία μπορούσε να ανιχνευθεί ακόμη και 7 μήνες μετά την εμφύτευση [15]. Αυτή η τεχνολογία αναπτύχθηκε αρχικά χρησιμοποιώντας ένα κλασικό πρωτεϊνικό αντιγόνο (λευκωματίνη ανθρώπινου ορού) και αργότερα εφαρμόστηκε με επιτυχία για το βακτήριο Salmonella Typhimurium και την πεπτιδογλυκάνη του M. luteus [19].

Η τεχνολογία των εμφυτεύσιμων εμβολίων έχει εφαρμοστεί με επιτυχία στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Τα εμφυτεύσιμα ικριώματα αποτελούνται από τρισδιάστατες μικροδομημένες επιφάνειες που παράγονται με τη χρήση λέιζερ υπερταχέων παλμών [20]. Είναι προτιμότερες από τις επιφάνειες 2-διαστάσεων (2D), καθώς προσφέρουν ένα πιο ρεαλιστικό τοπικό μικρο-περβάλλον για τη δραστηριότητα των κυττάρων. Όντως οι 2D επιφάνειες έχει δειχθεί ότι αλλάζουν το μεταβολισμό των κυττάρων και τα μοτίβα της γονιδιακής έκφρασης [21]. Επιπρόσθετα, έχει δειχθεί ότι η τρισδιάστατη μικρο/νανο τοπογραφία και η χημεία της επιφάνειας επηρεάζει τη διαφοροποίηση και μετανάστευση των μακροφάγων [22]. Η προτεινόμενη δόμηση επιφανειών με λέιζερ στενών παλμών παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα, δεδομένου ότι: α) είναι ευέλικτο και ανεξάρτητο υλικό β) είναι ταχύ, εύκολα προσαρμόσιμο και επεκτάσιμο μέσω της παράλληλης επεξεργασίας,  γ) επιτρέπει τη μοναδική δυνατότητα για ελεγχόμενα, υψηλής ανάλυσης χαρακτηριστικά τόσο στη μικρο- όσο και στη νανο-κλίμακα, το οποίο οφείλεται στον περιορισμένο επηρεαζόμενο όγκο, που βρίσκεται πολύ κοντά στον περιοριζόμενο από την περίθλαση όγκο. Πρόσθετα πλεονεκτήματα των λέιζερ περιλαμβάνουν την υψηλή απόδοση κατασκευής, απουσία επαφής αλληλεπίδρασης, εφαρμοσιμότητα σε πολλούς τύπους υλικών και αναπαραγωγιμότητα. Επιπλέον, η λειτουργία των λέιζερ μπορεί να ρυθμιστεί εύκολα με τη βοήθεια προγραμματισμού σε Η/Υ ώστε να εξασφαλίζεται η κατασκευή πολύπλοκων και εξατομικευμένων δομών σε 3D μήτρες σχεδιασμού. Τα συστήματα αυτά προκάλεσαν μια ευέλικτη κατηγορία τεχνικών παραγωγής ικριωμάτων που βασίζεται σε τεχνικές κατασκευής στερεάς ελεύθερης μορφής (SFF) με λέιζερ. Το SFF είναι ουσιαστικά μια ταχεία τεχνική παραγωγής πρωτοτύπων που επιτρέπει τον έλεγχο των μακροσκοπικών ιδιοτήτων, όπως το σχήμα, αλλά και τη μικροσκοπική εσωτερική αρχιτεκτονική του υλικού.

Παρόλο που τα νεοεπίτοπα δεν είναι από τοξικά ή μολυσματικά, τα ανοσοενισχυτικά και/ή το υλικό του φορέα μπορούν να έχουν παρενέργειες, η αξιολόγηση των οποίων θα μπορούσε να γίνει μόνο μετά από μαζική εφαρμογή, δημιουργώντας έτσι σοβαρά βιοηθικά ζητήματα. Η χρήση μη βιοδιασπώμενων εμφυτευμάτων αποφεύγει τις εξαρτώμενες από το ανοσοενισχυτικό παρενέργειες, ενώ παρέχει την απαραίτητη ανοσοδιέγερση στον ξενιστή [15]. Η παρούσα τεχνολογία έχει σχεδιαστεί ώστε να επιτρέπει στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα του ασθενή να παρουσιάζουν το «mutanome» του όγκου, εξασφαλίζοντας έτσι την καλύτερη παρουσίαση νεοαντιγόνου για κάθε άτομο. Σε μια τέτοια περίπτωση, ο έλεγχος των αντιγονικών νεοεπίτοπων θα πραγματοποιηθεί με φυσικό τρόπο από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, τα οποία κατά την εμφύτευση διεγείρουν τα Τ κύτταρα για ανάπτυξη ειδικής ανοσοαπόκρισης. Ο προσδιορισμός της βέλτιστης δόσης αντιγόνου in vitro είναι μια καθοριστική παράμετρος που πρέπει να καθορίζεται, καθώς αυτό θα υπαγορεύσει τον τύπο της  ανοσοαπόκρισης. Μικρές ή πολύ υψηλές συγκεντρώσεις αντιγόνου, καθώς και οι χαμηλής ή πολύ υψηλής συγγένειας αλληλεπιδράσεις TCR-αντιγόνου-MHC θα οδηγήσουν σε ανοχή αντί ανοσία. Παρέχοντας ολόκληρο το “mutotome” στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, καθορίζονται οι συνθήκες για την ανάπτυξη αντι-καρκινικών T_H, Tc καθώς και Β κυττάρων.

3. Η στρατηγική της εφαρμογής

Στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου η εφαρμογή της τεχνολογίας του εμφυτεύσιμου εμβολίου περιλαμβάνει 5 στάδια:

• Λήψη βιοψίας ασθενούς: Δεν απαιτείται ειδική παρέμβαση, διότι όλοι οι ασθενείς σε κάποιο στάδιο της νόσου έχουν υποβληθεί σε δειγματοληψία συμπαγούς όγκου. Δεν απαιτείται νέα βιοψία. Κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάζονται χωρίς τη χρήση χημικών ή ενζύμων.

2) Προσδιορισμός της αντιγονικότητας του ασθενούς στο εκχύλισμα όγκου: Λήψη αίματος από τον ασθενή για απομόνωση και έλεγχο λευκοκυττάρων. Αυτό το βήμα θα καθορίσει την πιο αποτελεσματική δόση του εκχυλίσματος όγκου που θα χρησιμοποιηθεί για τον ασθενή. Το εκχύλισμα των καρκινικών κυττάρων περιέχει όλα τα νεοαντιγόνα του συγκεκριμένου όγκου, έναντι των οποίων το ανοσοποιητικό σύστημα θα είναι σε θέση να ξεκινήσει μια κυτταρική και χυμική ανοσολογική αντίδραση. Η εύρεση της σωστής ανοσογονικής δόσης του εκχυλίσματος είναι απαραίτητη, καθώς θα πρέπει να υπερτερεί της πιθανής καταστολής που πιθανά να έχει αναπτύξει ο ασθενής έναντι των νεοαντιγόνων.

3) Φόρτωση κυττάρων στα μικροδομημένα ικριώματα πυριτίου: Λήψη αίματος για απομόνωση και καλλιέργεια των λευκοκυτάρων παρουσία του μικροδομημένου ικριώματος πυριτίου.

4) Ενεργοποίηση των προσκολλημένων κυττάρων: Η ανοσογόνος δόση του εκχυλίσματος όγκου που προσδιορίζεται από το βήμα 2 παρέχεται στα προσκολλημένα κύτταρα του βήματος 3. Μετά από επώαση 24 ωρών, τα μη προσκολλημένα κύτταρα αφαιρούνται και το μέσο καλλιέργειας αντικαθίσταται με φρέσκο μέσο που περιέχει την κατάλληλη δόση εκχυλίσματος κυττάρων όγκου, όπως ορίζεται στο βήμα 2.

5) Υποδερμική εμφύτευση του ενεργοποιημένου ικριώματος πυριτίου στον ασθενή και παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας. Η αποτελεσματικότητα της διαδικασίας είναι εμφανής μία εβδομάδα μετά την εμφύτευση.

4. Ασφάλεια της εφαρμογής

Ο σχεδιασμός των εξατομικευμένων εμφυτεύσιμων εμβολίων πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο της μέγιστης ασφάλειας για τον ασθενή, της απουσίας παρενεργειών και της ελάχιστης επιβάρυνσης για τον οργανισμό.

• Η χρήση αυτόλογων κυττάρων περιφερικού αίματος εξασφαλίζει την απουσία οποιωνδήποτε αντιδράσεων απόρριψης μοσχεύματος.
• Η χρήση της βιοψίας του ίδιου του ασθενούς εξασφαλίζει την ιδιαιτερότητα της αντίδρασης έναντι του συγκεκριμένου όγκου, ενώ ταυτόχρονα αποφεύγεται οποιαδήποτε αλλογενής αντιδραστικότητα.
• Η ex-vivo ενεργοποίηση των αυτόλογων κυττάρων με τα εκχυλίσματα των καρκινικών κυττάρων επιτρέπει τον προσδιορισμό των βέλτιστων συνθηκών για την επιθυμητή απόκριση.
• Η επιλογή ενός μη βιοδιασπώμενου υλικού ως βάση για τη δημιουργία ενός συστήματος που προσομοιάζει ένα δευτερογενές λεμφικό όργανο, εξασφαλίζει την απουσία υποπροϊόντων με άγνωστες παρενέργειες.

Προκλινικές μελέτες σε πειραματόζωα δείχνουν ότι υπό τις παραπάνω συνθήκες, το «ενεργοποιημένο» εμφύτευμα διεγείρει τον οργανισμό στον επιθυμητό βαθμό, ενεργοποιεί τα κυτταροτοξικά κύτταρα Tc έναντι του όγκου και προκαλεί την παραγωγή ειδικών για τον όγκο αντισωμάτων IgG.

Το «ενεργοποιημένο» εμφύτευμα παρέχει την απαραίτητη ανοσολογική μνήμη στον ξενιστή (ασθενή) έναντι του αρχικού αντιγόνου, το οποίο ανιχνεύεται ακόμη και 7 μήνες μετά την εφαρμογή, συστήνοντας έτσι την αφαίρεση του εμφυτεύματος 6 μήνες μετά την εμφύτευση.

5. Τοξικολογικές εξετάσεις

Το μόνο ξένο για τον οργανισμό υλικό που χρησιμοποιείται σε αυτήν την εφαρμογή είναι το Si-ικρίωμα, το οποίο αποτελείται από μονό κρύσταλλο τύπου-n πυρίτιο (1 0 0)  που υποβάλλεται σε ακτινοβολία λέιζερ σε θάλαμο κενού σε πίεση 10-2 mbar. Το διοξείδιο του πυριτίου (SiO₂) έχει προταθεί και χρησιμοποιείται σε κλινικές δοκιμές για την επικάλυψη μεταλλικών ενδοπροθεμάτων, την κατασκευή συσκευών χορήγησης φαρμάκων και εμφυτευμάτων [23, 24]. Σε αυτήν την εφαρμογή το Si-ικρίωμα χρησιμοποιείται ως τοπικό ήπιο ανοσοενισχυτικό απαραίτητο για την τόνωση του ανοσοποιητικού συστήματος αλλά αποφεύγοντας τις γενικευμένες παρενέργειες.

[1] Sukari A, Abdallah N, Nagasaka M. Unleash the power of the mighty T cells-basis of adoptive cellular therapy. Crit Rev Oncol Hematol. 2019; 136:1-12. doi: 10.1016/j.critrevonc.2019.01.015.

[2] Rosenberg SA, Packard BS, Aebersold PM, Solomon D, Topalian SL, Toy ST, et al. Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. A preliminary report. N Engl J Med. 1988;  319:1676-168.

[3] Lu YC, Robbins PF (2016). Cancer immunotherapy targeting neoantigens. Seminars in Immunology, 2015; 28: 22–27. doi:10.1016/j.smim.2015.11.002

[4] Zhang C, Liu J, Zhong JF, Zhang X. Engineering CAR-T cells. Biomark Res. 2017; 5:22. doi: 10.1186/s40364-017-0102-y.

[5] Hong M, Clubb JD, Chen YY. Engineering CAR-T Cells for Next-Generation Cancer Therapy. Cancer Cell. 2020; 38(4):473-488. doi: 10.1016/j.ccell.2020.07.005.

[6] Liu D, Zhao J, Song Y. Engineering switchable and programmable universal CARs for CAR T therapy. J Hematol Oncol. 2019; 12:69. doi: 10.1186/s13045-019-0763-0.

[7] Zerva Ι, Simitzi C, Stratakis E, Athanasakis I. Personalized Implantable Vaccines with Antigen PreActivated Macrophages. Austin J Clin Immunol. 2019; 6(1):1038

[8]  Thomas C, Tampe R. MHC I chaperone complexes shaping immunity.  Current Opinion in Immunology  2019; 58:9–15.

[9] [Burgdorf S, Kurts C. Endocytosis mechanisms and the cell biology of antigen presentation. Curr Opin Immunol. 2008; 20:89-95.

[10] Türeci Ö, Vormehr M, Diken M, Kreiter S, Huber C, Sahin U. Targeting the Heterogeneity of Cancer with Individualized Neoepitope Vaccines. Clin Cancer Res. 2016; 22(8):1885-96.

[11] Segal NH, Parsons DW, Peggs KS, Velculescu V, Kinzler KW, Vogelstein B, et al. Epitope landscape in breast and colorectal cancer. Cancer Res 2008; 68:889–92.

[12] Kreiter S, Vormehr M, van de Roemer N, Diken M, Lower M, Diekmann J, et al. Mutant MHC class II epitopes drive therapeutic immune responses to cancer. Nature 2015;520:692-6.

[13] Han Y, Liu D, Li L. PD-1/PD-L1 pathway: current researches in cancer. Am J Cancer Res. 2020;10(3):727-742.

[14] Meirow Y, Kanterman J, Baniyash M. Paving the road to tumor development and spreading: Myeloid-Derived Suppressor Cells are ruling the fate. Front Immunol. 2015; 6:523.

 [15] Zerva I, Simitzi C, Siakouli-Galanopoulou A, Ranella A, Stratakis E, Fotakis C, Athanassakis I. Implantable vaccines: In vitro antigen presentation enables in vivo immune response. Vaccine, 2015; 33: 3142–3149.

[16] Teh HS, Teh SJ. The Affinity/Avidity and Length of Exposure to the Deleting Ligand Determine Dependence on CD28 for the Efficient Deletion of Self-Specific CD4+CD8+ Thymocytes. Cellular Immunology, 2001; 207, 100-109. doi.org/10.1006/cimm.2000.1757.

[17] Love PE, Lee J, Shores EW. Critical Relationship Between TCR Signaling Potential and TCR Affinity During Thymocyte Selection. J Immunol September 15, 2000, 165 (6) 3080-3087; DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.165.6.3080

[18] Duong MN, Erdes E, Hebeisen M et al. Chronic TCR-MHC (self)-interactions limit the functional potential of TCR affinity-increased CD8 T lymphocytes. J. immunotherapy cancer 2019; 7, 284 doi.org/10.1186/s40425-019-0773-z

[19] Zerva I, Katsoni E, Simitzi C, Stratakis E, Athanassakis I. Laser micro-structured Si scaffold implantable vaccines against Salmonella Typhimurium.  Vaccine, 2019; 37: 2249-2257. doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.02.080

[20] Ranella A, Barberoglou M, Bakogianni S, Fotakis C and Stratakis E, Tuning cell adhesion by controlling the roughness and wettability of 3D mocro/nano silicon structures Acta Biomaterialia  2010; 6: 2711-2720

[21] Zhang S, Gelain F, Zhao X. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. Sem in Cancer Biol 2005:15: 413–20

[22]Van Goethem E, Poincloux R, Gauffre F, Maridonneau-Parini I, Le Cabec V. Matrix architecture dictates three-dimensional migration modes of human macrophages: differential involvement of proteases and podosome-like structures. J Immunol 2010 :184:1049-61

[23] Asano T, Suwannasom P, Katagiri Y, Miyazaki Y, Sotomi Y, Kraak RP, Wykrzykowska J, Rensing BJ, Piek JJ, Gyongyosi M, Serruys PW, Onuma Y. First-in-Man Trial of SiO2 Inert-Coated Bare Metal Stent System in Native Coronary Stenosis. Circ J 2018: 82: 477 – 485 doi: 10.1253/circj.CJ-17-0337

[24] Bernik DL. Silicon Based Materials for Drug Delivery Devices and Implants. Recent Patents on Nanotechnology 2007: 1: 186-192.

Όραμα

Ανάπτυξη ενός «Κέντρου εξωσωματικής ανοσοποίησης, ΚΕΑ»

Σχετικές δημοσιεύσεις των ιδρυτών:

Επιστημονικά άρθρα

1. Zerva, I., Simitzi, C., Ranella, A., Stratakis, E., Fotakis, C., Athanassakis, I. 3-dimensional laser structured scaffolds improve macrophage adherence and antigen-specific response. Procedia Engineering, 59: 211-218, 2013. http://dx.doi.org/10.1016/j.proeng.2013.05.113
2. Zerva, I., Simitzi, C., Siakouli-Galanopoulou, A., Ranella, A., Stratakis, E., Fotakis, C., Athanassakis I. Implantable vaccines: In vitro antigen presentation enables in vivo immune response. Vaccine 33: 3142–3149, 2015. http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.04.017
3. Ζέρβα I., Λαναρά X., Στρατάκης E., Αθανασάκη E. Εμφυτεύσιμα εμβόλια με τη χρήση προενεργοποιημένων ικριωμάτων πυριτίου στη θεραπεία του καρκίνου. Aνοσία; 14, 3: 49 – 52, 2018
4. Zerva, I., Katsoni, E., Simitzi, C., Stratakis, E., Athanassakis, I. Laser micro-structured Si scaffold implantable vaccines against Salmonella Typhimurium. Vaccine 37: 2249-2257 (2019) org/10.1016/j.vaccine.2019.02.080
5. Zerva Ι, Simitzi C, Stratakis E and Athanasakis I. Personalized Implantable Vaccines with Antigen PreActivated Macrophages. Austin J Clin Immunol. 2019; 6(1):1038
6. Zerva I, Pateraki V, Athanassakis I. Implantable vaccines: a solution for immune system manipulation to any antigenic stimulus. J Immunological Sci 2020; 4:5-11.
7. Αθανασάκη E. Νέα στρατηγική ανάπτυξης εξατομικευμένων εμβολίων στη λοίμωξη COVID-19. Ανοσία; 16, 3: 56 – 58, 2020.
8. Zerva I, Bakela K, Athanassakis I. Immunotherapy-on-chip against an experimental sepsis model.  Inflammation 2021 (in press)

Παρουσιάσεις/ προσκλήσεις σε συνέδρια

1. Zerva, I., Simitzi, Ch., Ranella, A., Stratakis, E., Fotakis, C., Athanassakis, I. 3-dimensional laser structured scaffolds improve macrophage adherence and antigen-specific response. European Congress of Immunology, September 5-8, 2012, Glasgow, Scotland (travel grant award)
2. Zerva, I., Simitzi C., Ranella A., Stratakis E., Fotakis C., Athanassakis I. 3-dimensional laser structured scaffolds improve macrophage adherence and antigen-specific response. ICTE2013, International Conference of Tissue Engineering, June 2013, Portugal.
3. Zerva, I., Simitzi C., Ranella A., Stratakis E., Fotakis C., Athanassakis I. 3-dimensional laser structured scaffolds improve macrophage adherence and antigen-specific response. TERMIS-EU 2013 June 17-20 Istanbul.
4. Ranella A., Zerva, I., Simitzi C., Fotakis C., Stratakis E., Athanassakis I. 3D micro laser textured transplantable scaffolds improve macrophage adherence and antigen-specific response. E-MRS 2013 FALL MEETING September 16-20, Warsaw University of Technology.
5. Zerva, I., Simitzi C., Ranella A., Stratakis E., Athanassakis I. Biomaterial-induced inflammatory reaction upon in vivo implantation in mice.  E-MRS 2014 FALL MEETING, Warsaw University of Technology.
6. Zerva, I., Simitzi, C., Stratakis, E., Ranella, A., Athanassakis, I. Transplantable immune modulation in response to autologous cancer cells. 4^th European Congress of Immunology, September 6-9, 2015, Vienna
7. Zerva I., E. Katsoni E., Simitzi C., Ranella A., Stratakis E., Athanassakis I. Differential behavior of laser micro-structured Si scaffolds according to the biological stimulant. 10th FRONTIERS IN IMMUNOLOGY RESEARCH INTERNATIONAL CONFERENCE Island of Crete, Greece Minoa Palace Resort & Spa, July 1-4, 2017
8. Zerva, I., I.Athanassakis, I. «Εξατομικευμένα Εμφυτεύσιμα Εμβόλια για τον καρκίνο του μαστού» Συνέδριο Κλινικής και Μεταφραστικής Ογκολογίας, Ηράκλειο, Ελλάδα., 2017
9. Zerva, I., Kouimtzidis, A., Pateraki,V., Lanara,C., Stratakis, E., Athanassakis,I «Implantable, pre-activated microconed-Si scaffold vaccines for cancer therapy».  5th European Congress of Immunology-ECI 2018, Άμστερνταμ, Ολλανδία, 2018.
10. Πατεράκη B., Ζέρβα I., Λανaρά X., Στρατάκης, E., ², Ε. Αθανασάκη E. ΕΞΑΤΟΜΙΚΕΥΜΕΝΑ ΑΝΟΣΟΕΜΦΥΤΕΥΜΑΤΑ ΙΚΡΙΩΜΑΤΩΝ ΠΥΡΙΤΙΟΥ  ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ, 11^ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ανοσολογίας, Αθήνα, Δεκέμβριος 2019.
11. Αθανασάκη Ε. Νέα στρατηγική ανάπτυξης εξατομικευμένων εμβολίων στη λοίμωξη COVID-19. Ετήσιο Συνέδριο Ανοσολογίας 2020, Αθήνα, Νοέμβριος 2020. INVITED SPEAKER
12. Bakela K, Zerva I, Athanassakis I. Immunotherapy-on-chip against an experimental sepsis model. 14^thGlobal Summit on Immunology and Cell Biology, March 22-23, 2021
13. Αθανασάκη Ε. Τεχνολογία εξατομικευμένων εμφυτεύσιμων εμβολίων: αποτελεσματικότητα και ασφάλεια. ΕΕΑ, Παγκόσμια Ημέρα Ανοσολογίας 2021, Μάϊος 2021. INVITED SPEAKER
14. Zerva I, Bakela K, Athanassakis I.  Immunotherapy-on-chip against an experimental sepsis model. 6th European Congress of Immunology – ECI 2021 which will take place virtually from September 1-4, 2021. (EFIS grant award-EFISGrantECI2021)

Πατέντες

1. Athanassakis, I., Zerva, I., Simitzi, C., Ranella, A., Stratakis E., Personalized implantable vaccines using antigen pre-activated monocytes (Εξατομικευμένα εμφυτεύσιμα εμβόλια με αντιγονικά διεγερμένα μονοκύτταρα). ΟΒΙ 20140100471, 19/9/2014 https://worldwide.espacenet.com/patent/search/family/056090633/publication/GR1008652B?q=20140100471
2. Athanassakis I., Zerva, I., Stratakis E. Personalized implant against cancer. Εξατομικευμένο εμφύτευμα κατά του καρκίνου. ΟΒΙ 20190100297
3. ImmunoRec IKE. Personalized vaccine against SARS-CoV-2 (OBI 245-0004327167, under evaluation)